大豆多肽的分子量分布测定及体外消化实验

大豆多肽是指大豆蛋白质经蛋白酶作用后，再经特殊处理而得到的蛋白质水解产物，它由大豆蛋白水解后的许多种肽分子混合物所组成，产品中还含有少量游离氨基酸、糖类和无机盐等成分。大豆多肽的氨基酸组成几乎完全与大豆蛋白质一样，必需氨基酸的平衡良好，含量也丰富。同时，大豆多肽还具有抗高血压、免疫调节、改变食品口味及性状等功能。因此，大豆多肽是一种具有保健功能的食品，市场前景十分广阔。但是，大豆多肽的功能性取决于其品质，为此，我们对中食都庆(山东)生物技术有限公司生产大豆多肽进行了分子量分布测定及体外消化实验。 1. 材料和方法 1.1. 材料 1.1.1. 样品中食都庆(山东)生物技术有限公司生产的大豆多肽（干粉）。 1.1.2. 试剂 消化酶：胃蛋白酶，华美生物工程公司提供，活性1∶3000；胰蛋白酶，华美生物工程公司提供，活性1∶250。 缓冲液：缓冲液A，0.05 mol/L HCl-KCl；缓冲液B，0.05 mol/L KH2PO4-NaOH。 1.1.3. 仪器 毛细管液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱仪（CapLC Q-TOF2），英国Micromass 公司。Waters 600 HPLC，凝胶色谱柱为Waters Pak60，沃特斯公司；反相色谱柱为CenturySIL C8 300A，大连江申分离科学技术公司。 1.2. 方法 1.2.1. 分子量分布 将大豆多肽溶解于水，用HPLC进行凝胶过滤，收集各主要峰，用质谱法测定各组分的分子量。 1.2.2. 多肽序列测定 将大豆多肽溶解于水，直接用质谱法测定多肽的氨基酸序列。 1.2.3. 体外消化 1.2.3.1. 胃蛋白酶消化 称取大豆多肽粉1g，加缓冲液A 10ml，留取1ml作为对照；剩余的样品中加入0.09g胃蛋白酶，37℃水浴3小时，然后进行HPLC分析。 1.2.3.2. 胰蛋白酶消化 称取大豆多肽粉1g，加缓冲液A 10ml，留取1ml作为对照；剩余的样品中加入0.19g胰蛋白酶，37℃水浴3小时，然后进行HPLC分析。 1.2.4. HPLC分析： 1.2.4.1. 凝胶过滤色谱：流动相，水；流速0.5ml/min；上样量10-20ul。 1.2.4.2. 反相色谱：流动相A，0.1%TFA，流动相B，乙腈+0.1%TFA；洗脱梯度，0-70%流动相B 20分钟，流速0.5ml/min。 2. 结果 2.1. 分子量分布 大豆多肽凝胶过滤色谱图见图1，收集其中7个主要的组份（如图中所示）用质谱进行分子量测定。 图 1 凝胶过滤色谱图 凝胶过滤后各主要组份分子量测定结果见图2~图9。 2分子量测定 图 3分子量测定 图 4分子量测定 图 5分子量测定 图 6分子量测定 图 7分子量测定 图 8分子量测定 图 9分子量测定 从以上结果可以看到，大豆多肽的分子量均在1000道尔顿以下，主要的分子量分布为245.12，274.27，318.30，491.25，531.31，569.32， 589.31，682.37。 2.2. 多肽序列测定 用质谱法测出了三个多肽序列，具体如下： a) Leu Ala Pro Glu Glu b) Met Ser Leu Pro Thr Asn c) Arg Leu Met Leu His Leu Ala Pro 2.3. 胃蛋白酶消化 2.3.1. 凝胶过滤色谱 大豆多肽胃蛋白酶消化前后的凝胶过滤色谱图见图10和图11。 图 10大豆多肽凝胶过滤色谱图（未消化） 图 11大豆多肽凝胶过滤色谱图（胃蛋白酶消化后） 结果显示，胃蛋白酶消化后，大豆多肽的凝胶色谱图基本上没有变化。 2.3.2. 反相色谱 大豆多肽胃蛋白酶消化前后的反相色谱图见图12和图13。 图 12大豆多肽反相色谱图（未消化） 图 13大豆多肽反相色谱图（胃蛋白酶消化后） 反相色谱图显示，胃蛋白酶消化后，在保留时间4.141分钟处增加一个峰，约占总面积的1.33%，其他峰形基本没有变化。 2.4. 胰蛋白酶消化 2.4.1. 凝胶过滤色谱 大豆多肽胰蛋白酶消化前后的凝胶过滤色谱图略有变化，但其变化率不超过5%，见图14和图15。 图 14大豆多肽凝胶过滤色谱图（未消化） 图 15大豆多肽凝胶过滤色谱图（胰蛋白酶消化后） 2.4.2. 反相色谱 大豆多肽胰蛋白酶消化前后的反相色谱图见图16和图17。 图 16大豆多肽反相色谱图（未消化） 图 17大豆多肽反相色谱图（胰蛋白酶消化后） 通过比较图16和图17可以发现，经胰蛋白酶处理后，大豆多肽的反相色谱图中增加了至少三个较明显的峰，约占总面积7.39%，相应的其他峰的相对面积有所改变。 3. 结论 现代生物代谢试验发现，蛋白质并非必须通过消化道中的多种蛋白酶水解后，最终以氨基酸的形态才能被人体吸收，而是大部分在多肽（特别是二、三肽）形态时就能直接吸收。在用合成肽做的实验中，发现二肽和三肽的吸收速度比同一组成的氨基酸快。短肽的吸收率比氨基酸大，比氨基酸更易、更快被机体吸收利用；短肽的低抗原性使得食后不会引起过敏反应；且短肽的渗透压比氨基酸低，食后也不会引起痢疾等不良反应；短肽还具有良好的感官效应。 本研究结果显示，中食都庆(山东)生物技术有限公司生产的大豆多肽分子量均低于1000，且主要集中在245-700之间，即大多由2~6个氨基酸组成；经胃蛋白酶处理后，该大豆多肽95%以上未被消化，经胰蛋白酶处理后， 约90%未被消化，说明其大部分将以多肽的形式被直接吸收。因此，该大豆多肽可以开发成功能性食品。 因此，大豆多肽是一种具有多种保健功能的功能性食品添加剂原料，市场前景十分广阔。但是，肽类产品的功能性取决于其产品分子量分布和产品在体内经消化道后的稳定性，为验证中食都庆（山东）生物技术有限公司生产大豆多肽产品质量，我们对该产品进行了分子量分布测定及体外消化实验，目的是为肽而康产品为原料开发功能保健系列产品提供产品稳定性的理论依据。 试验样品为大豆多肽产品。试剂为胃蛋白酶和胰蛋白酶。缓冲液自制。缓冲液A，0．05mol／LHCl－KCl；缓冲液B，0．05mol／LKH2PO4－NaOH。试验仪器有英国Micromass公司毛细管液相色谱－四极杆－飞行时间串联质谱仪（CapLCQ－TOF2）；沃特斯公司的Waters600HPLC，凝胶色谱柱为WatersPak60；大连江申分离科学技术公司的反相色谱柱CenturySILC8300A。分子量分布的测定方法是将大豆多肽溶解于水，用HPLC进行凝胶过滤，收集各主要峰，用质谱法测定各组分的分子量。 多肽序列测定的方法是将大豆多肽溶解于水，直接用质谱法测定多肽的氨基酸序列。 体外消化包括胃蛋白酶消化和胰蛋白酶消化。称取大豆多肽粉1g，加缓冲液A10ml，留取1ml作为对照；剩余的样品中加入0．09g胃蛋白酶（0．19g胰蛋白酶），37℃水浴3小时，然后进行高效液相色谱法（HPLC）分析。LQ HPLC分析：凝胶过滤色谱：流动相，水；流速0．5ml／min；上样量10～20μl。反相色谱：流动相A，0．1％TFA，流动相B，乙腈＋}0．1％TFA；洗脱梯度，0～70％流动相B20分钟，流速0．5ml／min。 本研究结果显示，中食都庆（山东）生物技术有限公司生产的大豆多肽分子量均低于1000，且主要集中在245～700之间，即大多由2～6个氨基酸组成；经胃蛋白酶处理后，大豆多肽的凝胶色谱图基本上没有变化，说明该大豆多肽95％以上未被消化；经胰蛋白酶处理后的凝胶过滤色谱图与处理前略有变化，但其变化率不超过5％，约90％的大豆肽未被消化，说明该产品具有良好的稳定性，在体内大部分将以多肽的形式被直接吸收。同时应用该大豆多肽产品开发功能性食品时，大豆多肽本身所具有的各项生理功能将不应发生改变。